Ферменты — это вещества, вырабатываемые живыми организмами; они обладают каталитическим действием, т. е. способностью увеличивать скорости определенных химических реакций. На ферментативном действии основаны процессы брожения, с доисторических времен применяемые при производстве вин, уксуса, пива и хлеба. В 1680 г. голландский натуралист Антони Левенгук использовал микроскоп собственной конструкции для наблюдения клеток дрожжей и бактерий; однако он не считал их живыми организмами. В 1857 г. Луи Пастер показал, что дрожжи представляют собой живой организм, а брожение— физиологический процесс. В 1897 г. Э. Бюхнеру удалось доказать, что брожение может происходить без участия целых дрожжевых клеток. Проэкстрагировав дрожжевые клетки, он получил раствор, не содержащий клеток, но обладающий ферментативной активностью (содержащий фермент, или энзим). Слово «энзим» происходит от греческого еn zyme — в закваске.
Вплоть до 1926 г. не было получено никаких данных, свидетельствующих о том, что ферменты — это белки. Только в 1926 г. Джеймсу Б. Самнеру (1887—1955), работавшему в Корнеллском университете, удалось выделить из соевых бобов в чистом виде и получить в кристаллической форме фермент уреазу. Уреаза — белок, катализирующий гидролитическое расщепление мочевины
CO(NH2)2 + Н2O → СO2 + 2NH3
Молекулярная масса уреазы 480 000; молекула состоит из шести субъединиц. Последовательность аминокислотных остатков в ее молекуле пока не установлена.
Механизм каталитического действия ферментов
В разд. 10.5 уже говорилось, что катализатор повышает скорость реакции (так же, как и скорость обратной реакции), поскольку обладает способностью снижать энергию активации данной реакции. Это достигается благодаря более сильному взаимодействию катализатора с активированным комплексом, являющимся переходным состоянием между молекулами реагентов и молекулами продуктов реакции. В качестве примера рассмотрим гидролиз мочевины, катализируемый ферментом уреазой. Молекула мочевины плоская; ее электронную структуру можно представить как гибрид следующих трех структур:
Чтобы образовались продукты гидролиза СO2 + 2NH3, молекула воды должна сблизиться с молекулой мочевины, при этом атом кислорода воды должен приблизиться к атому углерода мочевины почти с противоположной стороны по отношению к атому кислорода мочевины, в то же время оба атома водорода должны примкнуть к атому азота. Промежуточный комплекс, вероятно, включает деформированную молекулу мочевины, в которой атом углерода выведен из плоскости NNO, а четыре атома водорода оттянуты от этой плоскости. Такая деформация облегчается, если в процессе участвуют NH- или ОН-группы фермента, которые способствуют образованию водородных связей между атомом кислорода мочевины, атомами кислорода фермента и двумя атомами азота мочевины; в то же время группа фермента, не образующая водородной связи, например группа СН2, отталкивает атом углерода мочевины. Молекула воды также может удерживаться ферментом в положении, удобном для деформированной молекулы мочевины. При температуре тела человека уменьшение энергии активации на 5,93 кДж·моль-1 приводит к десятикратному увеличению скорости реакции (разд. 10.4). Энергия водородной связи О—Н • • • О или N—Н • • • О равняется примерно 20 кДж·моль-1. Отсюда следует вывод о необходимости считаться с тем, что энергия деформации, обусловленная рядом водородных связей, может быть равной 25—30 кДж·моль-1, а это значит, что скорость реакции может увеличиться в 10 000—100 000 раз, что и наблюдается в некоторых реакциях, катализируемых ферментами.
Область, в пределах которой реагирующие молекулы прилегают одна к другой (образуя переходный комплекс или переходное состояние), называется активным центром фермента. Для уреазы эта область не должна быть очень большой — она должна лишь немного превышать размеры молекулы мочевины. Напрашивается вопрос, почему же тогда столь велика молекула фермента, насчитывающая тысячи атомов. Частично это объясняется, по-видимому, тем, что атомы, образующие активную область, должны прочно удерживаться в определенных положениях, и другие атомы молекулы фермента обеспечивают стабильность таких положений. Кроме того, локальное атомное окружение во многих ферментативных реакциях очень сильно отличается (например, в случае гидрофобности) от окружения в водной среде, в которой действуют ферменты, и большие молекулы фермента обеспечивают возможность таких локальных изменений.
Сложные белки. Коферменты
В состав молекул некоторых белков входят только полипептидные цепи. Такие белки называют простыми. Однако у многих белков молекулы состоят из полипептидных цепей и других групп или молекул. Молекула гемоглобина человека, например, состоит из четырех полипептидных цепей и четырех гемов (гем — органическое ионное соединение). Такие белки называют сложными белками, а небелковую часть — простетической группой.
Многие ферменты представляют собой сложные белки, образованные простым белком — апоферментом («апо» означает «вне, отдельно от») и одной (или более) молекулой или ионом, называемыми коферментами. Некоторые коферменты являются ионами металлов. Примером может служить карбоангидраза в эритроцитах человека. Ее апофермент имеет молекулярную массу 28 000. Апофермент соединяется с одним ионом цинка (Zn2+) и образует активный фермент, который катализирует распад угольной кислоты на двуокись углерода и воду. Другим примером может служить амилаза, содержащаяся в слюне человека и участвующая в процессе переваривания крахмала. Молекулярная масса амилазы 50 000, коферментом в ней является один ион кальция Са2+. Для многих ферментов коферментами служат витамины или их производные.
Кинетика ферментативных реакций
Скорость многих реакций, катализируемых ферментами, описывается простым уравнением — уравнением Михаэлиса — Ментена [уравнением (14.1)]. Исходное вещество в таких реакциях обычно называют субстратом. Допустим, что реакция протекает через сочетание фермента Е и субстрата S с образованием комплекса ЕS, который затем может распадаться двумя путями — снова с образованием Е и S или же с образованием Е и продуктов реакции Р:
Если значение константы скорости k невелико, то концентрация ЕS приближается к равновесному значению:
$\frac{[ES]}{[E][S]}=K$ (14.1)
В данном случае скорость реакции пропорциональна [ЕS] и, следовательно, [Е][S]:
$-\frac{d[S]}{dt}=k[ES]=kK[E][S]$ (14.2)
Общая концентрация фермента равна [Е]Oбщ =[ Е] + [ЕS]. Из уравнения (14.1) следует, что
$[E]=\frac{[E]_{Oбщ}}{K[S]+1}$
и поэтому уравнение (14.2) можно переписать в виде
$Скорость=-\frac{d[S]}{dt}=\frac{K[S][E]_{Общ}}{[S]+\frac{1}{K}}$ (14.3)
Из этого уравнения следует, что, когда [S] по сравнению с К-1 небольшая величина, скорость реакции пропорциональна [S] и равна kK[S][E]общ, а если [S] настолько велика, что обеспечивает насыщение данного фермента, то скорость становится независимой от [S] и точно равна k[Е]общ. На рис. 14.5 показаны некоторые рассчитанные кривые.
Интересно сравнить кривую для K = 0,5 с кривой рис. 14.6, построенной по экспериментальным значениям, которая показывает скорость роста мутанта красной хлебной плесени в пробирке, содержащей питательный раствор, в зависимости от концентрации в данном растворе ростового вещества — n-аминобензойной кислоты. Сходство форм кривых указывает на то, что скорость роста данного микроорганизма определяет равновесие, соответствующее уравнению (14.1).
Рис. 14.5. Кривые зависимости вычисленных значений скорости R/R∞ катализируемой реакции от концентрации субстрата или кофермента для разных значений константы равновесия К процесса образования фермент-субстратного или апофермент-коферментного комплекса.
Рис. 14.6. Наблюдаемая скорость роста мутанта Neurosрога (красной хлебной плесени), нуждающегося в n-аминобензойной кислоте (по данным Тейтама и Бидла, 1942), как функция концентрации ростового вещества в среде.
Возможно, что определяющим является не равновесие между ферментом и субстратом, а равновесие между апоферментом (белком без ферментативной активности) и коферментом (часто витамином) с образованием активного фермента
А + С ⇔ Е
$\frac{[E]}{[A][C]}=K^{'}$ (14.4)
Нетрудно убедиться, что концентрация кофермента оказывает такое же влияние на скорость данной реакции, как и концентрация субстрата.
Известно, что многие заболевания связаны с мутациями генов приводящими к понижению активности какого-либо важного фермента в организме человека. Такое понижение ферментативной активности может быть обусловлено образованием измененного апофермента со значительно более низкой константой К' реакции соединения со своим коферментом. Примером такого заболевания может служить цистатионинурия, которую распознают по наличию в моче цистатионина — производного аминокислоты метионина (табл. 14.1). Цистатионинурия приводит к задержке умственного развития и сопровождается неприятными физическими проявлениями. Происходящий в организме процесс превращения цистатионина протекает с участием фермента, роль кофермента в котором играет пиридоксин (витамин В6). Пиридоксин обычно назначают в дозах ~1 мг в день. Установлено, что стократная доза приводит к исчезновению цистатионина в моче при одновременном исчезновении других проявлений этого заболевания; вероятно, это связано со сдвигом равновесия реакции (14.4) в направлении образования активного фермента. Этот пример показывает, каким образом можно использовать принципы химического равновесия и химической кинетики при изучении болезней.
Ингибиторы ферментов
Ингибитор фермента — вещество, соединяющееся с ферментом и лишающее его каталитической активности. Ингибитор может конкурировать с субстратом или быть неконкурентным. Если ингибитор конкурентный, то степень ингибирования фермента определяется соотношением концентраций ингибитора и субстрата. Молекулы ингибитора и субстрата конкурируют за присоединение к одному и тому же активному центру молекулы фермента.
Примером конкурентного ингибирования может служить ингибирование сукцинатдегидрогеназы малонат-ионом. В этом случае катализируемая реакция — окисление сукцинат-иона до фумарат-иона
-ООС—СН2—СН2—СОО- + ½O2 → -ООС—СH=CH—СОО- + H2O
В малонат-ионе -ООС—СН2—СОО- две карбоксильные группы расположены ближе друг к другу, чем в сукцинат-ионе. Опытным путем установлено, что константа равновесия связывания малонат-иона почти такая же, как и в случае связывания сукцинат-иона (около одной трети последней, что соответствует разности в энергии связывания Гиббса 2,8 кДж·моль-1, а это мало по сравнению с общей энергией Гиббса связывания фермента с каждым из ионов). Можно сделать вывод, что связывающие центры молекулы данного фермента для двух карбоксильных групп находятся на таком расстоянии, которое равно среднему значению расстояний между карбоксильными группами в недеформированных сукцинат- и малонат-ионах.
Наиболее сильные яды вызывают смерть потому, что ингибируют ферменты, необходимые для жизнедеятельности организма. Цианистоводородная кислота и сероводород образуют ионы CN- и HS-, которые соединяются с атомами железа (III) в цитохромах, представляющих собой гемсодержащие ферменты, катализирующие внутриклеточные реакции окисления (тканевое дыхание), весьма существенные для жизни. Многие лекарственные препараты действуют как ингибиторы ферментов.
Часто продукты, образующиеся в результате реакции, катализируемой ферментами, сами служат ингибиторами ферментов. Благодаря этому возникает весьма эффективный механизм обратной связи, предотвращающий возможность образования продуктов реакции в излишне больших концентрациях.
В некоторых случаях действие того или иного фермента регулируется не субстратом или продуктами ферментативной реакции, а веществом, отличным от них. Такие ферменты называют аллостерическими ферментами. Участок в молекуле фермента, который реагирует с аллостерически действующей молекулой, не совпадает с активным центром фермента. Несовпадение места присоединения аллостерических молекул и активного центра фермента удалось наблюдать при рентгеноструктурном анализе аспартаттранскарбамилазы — фермента, молекула которого состоит из шести субъединиц и имеет массу 310000.